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01-142021

大咖论“谱”|刘华芬:液相色谱-串联质谱技术临床应用思考与面临的挑战

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以下文章来源于检验视界网 ,作者刘华芬

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刘华芬,杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司创始人。美国东密执根大学/密执根大学联合分析化学硕士;密执根大学药学博士就读。中国医师学会检验医师分会临床质谱专家委员会委员,杭州医学院特聘教授。美国与中国临床质谱应用领域的重要开拓者,业内知名资深质谱应用专家。2017年回国前,曾任美国辉瑞制药研究员,罗氏制药科学家,丹纳赫SCIEX公司质谱应用创新平台全球总监、高级科学家、北美/亚太质谱应用及支持总监。她曾在国际一流刊物及国际会议发表超过100多篇文章或文献。

液相色谱-串联质谱技术(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry LC-MS/MS)因其独特的灵敏度、特异性及一次进样可以检测多种生物标志物等优势,已逐渐成为临床生化小分子标志物的推荐方法。液相色谱-串联质谱技术最早应用于科研,上世纪九十年代产业化后,首先应用于药物研发,并随着技术的发展在2000年前后逐渐应用于小分子代谢产物等生物标志物的临床检验工作。北美地区临床检验整体市场中第三方独立医学实验室占比较高,因此临床质谱更多在第三方独立医学实验室及中心医疗机构中得到应用。北美临床质谱技术应用方法的监管主要依托于CLIA法规下的临床质量管理及CAP实验室认证体系,所有方法的建立、分析性能及临床性能验证都有严格的要求。在CLIA法规下,由于实验室自建项目(Laboratory Developed Test, LDT)的开放,临床质谱近10多年在北美得到长足发展。在中国,质谱技术最早应用于药物临床试验及新生儿遗传代谢病的筛查。2007年前后,国内部分独立医学实验室及一些技术力量雄厚的三甲医院开始开展临床质谱检测项目。虽然北美和中国临床质谱起步时间接近,但由于国内缺少IVD 注册的质谱设备、缺乏对LDT 的政策支持、第三方独立实验室市场占比小、相关收费标准更新不及时,技术人员专业培训不足,且无可持续发展的商业模式等等原因,使得质谱技术在中国临床实验室诊断中的应用发展缓慢。近两年,在行业各界,包括专家资源和资本力量的共同推动下,各个质谱厂商陆续向市场上推出一系列获得IVD注册的质谱仪器及试剂盒,液相质谱-串联质谱技术在中国临床领域的应用进入了快速发展时期。LC-MS/MS的质量保证首先取决于开发和验证准确而可靠的方法。为此,行业内专家已发表如CLSI-C62A、《液相色谱-质谱临床应用建议》、《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》等一系列指南建议与专家共识。


液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)是通过质量分析器测定带电粒子质荷比的一种分析技术:MS/MS是将2个质量分析器由碰撞室串接起来的分析设备,即三重四极杆质谱仪。第一级质量分析器筛选出被离子化的样本中特定质荷比的母离子,母离子进入碰撞室,通过碰撞诱导解离的方式形成碎片子离子;第二级质量分析器筛选出特异性强的定量子离子及定性子离子,子离子进入检测器 MRM(多反应离子)监测,最终得到目标分析物的含量。每个母离子/子离子对被称为1个“质量通道”,只有具有特定“质量通道”的待测物质,才能进入检测器。因此,MS/MS具有很好的检测特异性。此外,质谱方法具有同时检测多离子通道的独特优势,即使在检测背景信号高的内源性化合物时,亦可通过同时监测两个离子碎片通道,实现待测物质的精准检测。因此,当LC-MS/MS方法首次被引入常规临床检验实验室时,其准确性应当是可以被保证的。但是,尽管液相色谱-串联质谱技术被认为是小分子生物标志物的金标准,却由于标准物质的缺乏,仪器,色谱柱,试剂,方法学和验证准确度缺乏标准化等因素的影响,导致相同的被检测物质在实验室内部和实验室之间都存在较大的偏倚和不精确性。因此,在这里,我想从几个层面和大家分享一下中国临床质谱应用健康发展中的几个核心挑战。 

01

准确度的基本条件:标准物质和内标物的选择

具有溯源性和互换性的有证标准物质是实现量值溯源、是标准曲线准确检测结果准确一致的基本保证。目前,国内外研制标准物质的权威机构有:中国计量科学研究院(National Institute of Metrology, China)、美国国家标准和技术研究院(National Institute of Standards and Technology, NIST)以及其它组织如Sigma-Aldrich公司旗下子公司Cerilliant等。实验室在可能的情况下,需要溯源至国家最高级别标准物质,若不可获得,可以溯源至低一级别标准物质或厂家提供的标准物质。一般临床检验实验室如果采用已上市二类试剂进行检测,校准物和质控物的靶值见相应批次产品的赋值证书。若条件允许,厂家校准物应该溯源至经过检验医学溯源联合委员会(JCTLM)确认的高等级标准物质。在现阶段很多标准物质缺乏也是质谱临床检测中主要的挑战。


LC-MS/MS分析过程中的内标物可用于校正基质效应以及样本前处理、色谱分离和离子化过程引入的偏差,有助于提高定量分析的准确度、精密度。一般要求内标物的分子量至少比目标分析物大3个分子量,内标物化学纯度≥98%,同位素标记纯度≥97%,一般同位素内标浓度水平在标准曲线中位点浓度。如果低于该要求纯度,则其未标记的化合物浓度会与待测内源待测物的检测下限接近,导致检测结果系统性偏高。因此,必要时应对内标物的纯度进行测试,以避免其中含有与目标分析物共洗脱且具有相同质量数的干扰物质。检测系统准确性可通过方法间比较、检测基质样品的加样回收率,并同时检测在患者样本、患者混合样本、血清质控品、非生物水溶液等不同基质中的准确性。

02

基质效应对液相质谱离子化的影响

不同于生化免疫方法主要依赖抗原抗体的反应,质谱是基于分子结构本身进行的直接检测。分子离子化的过程是在大气压下通过探针高压放电及液相高温喷雾使化合物增加或者失去电荷来实现。离子源的离子化效率及稳定性,高浓度化合物对低浓度的离子化的抑制以及样本内杂质的基质效应是质谱检测常见的挑战。基质效应可能会对分析结果的准确性及特异性产生影响,例如离子抑制效应引起灵敏度或离子化效率的降低导致检测结果低于实际浓度,而由干扰峰干扰可能导致检测浓度的高于实际浓度,因此评估基质效应及基质干扰是LC-MS/MS方法验证的关键组成部分。另外,人体中生物标志物浓度差异很大,比如,人体内激素类从 pg/mL到 ug/mL不同浓度,普通检测器很难满足同时对这几种化合物在线性范围进行检测并满足其高灵敏度的要求。不同于外源性的药物浓度检测,临床检测的生物标志物多为人体内的内源性化合物,因此难以制备空白血清或者基于相同的血清介质直接配制标准曲线。因此,通过样品处理技术有效去除样品中的基质,有效的液相色谱的分离及同位素内标矫正离子化效率差异是准确检测结果的基本保证。

03

临床样本质谱离子对的选择

质谱通过离子源对分子的添加或者失去电荷形成母离子并在第二个四级杆通过能量的碰撞形成不同的子离子碎片。随着质谱技术及软件的发展,溶液基质中的离子对的选择可以通过仪器软件自动产生。但在基质样品的分析方法开发过程中,首先需要根据目标分析物的官能团确定母离子/子离子对。一般应避免选择损失质量数为18的脱水离子碎片,因其在基质中的背景噪音偏高。而后还需优化质谱仪各项参数:包括离子源参数以及质谱扫描参数,以获得最佳的离子对响应值。最终定量离子对应通过基质处理后的样本筛选以保证背景型号干扰最低。不同于药物研发中外源化合物,临床液相质谱定量分析需要一个分析物使用2个MRM离子通道,分别作为定量离子通道和定性离子通道。未知样品中定性和定量两个离子通道的比例需要和标准品及QC样品的两个离子通道的比例在误差可接受的范围内保持一致,以确保无同分异构干扰物质。需要注意的是,在任何给定时间内(例如,通过单次进样监测多种分析物时)监测到的离子对通道越多,单个色谱峰可采集到的数据点就越少,如果用于表征色谱峰面积的数据点数量不足,数据的可靠性可能会受到影响。

04

具有临床意义的检测套餐设计

质谱技术一大优势可以同时检测多种生物标志物,对于从多维度了解疾病有着重要的意义。人体中不同的内源性生物标志物具有不同的存在形式,甚至大多数时候是由多种形式共存,因此选择具有临床诊断意义并同时有具有很好的化学稳定性,化学属性及生物活性的检测标志物十分关键。比如对于维生素D,目前体内可检测到的维生素D的代谢物约有40多种,常规检测的是ng/ml血清浓度的单羟基25-OHD2和25-OHD3。但对于肾功能异常的人群,特别是对肾透析患者,进行具有生物活性的微量(pg/ml)双羟基代谢产物1,25-(OH)2D血清浓度检测才更具有临床意义。1,25-(OH)2D 在正常肾功能的人中浓度为 20~60 pg/ml,比我们常规检测的单羟基代谢产物低1000 倍左右。其半衰期只有4h,所以检测的挑战很大,目前最好的办法就是免疫富集并利用液相色谱-串联质谱技术进行检测。因为对于肾功能异常的患者,补充维生素D会造成患者钙化,临床一般直接补充1,25-(OH)2D。


对于水溶性维生素,例如维生素B6,又称吡哆素,包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺三种亚型及其磷酸衍生物。血浆中的磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate,PLP)主要是由肝脏产生,占到维生素B6主要代谢物的70%~90%左右,是主要的活性形式,也是氨基酸、糖类和脂类代谢过程中的重要辅酶,参与上百种酶催化反应,对维持神经系统和免疫系统健康所必需的,且在维持血液中同型半胱氨酸正常水平中扮演重要角色。此外,血浆中还有少量吡哆酸,是维生素B6排泄到尿液中的主要形式。因此,血清中磷酸吡哆醛的检测更具有实际临床意义。


还例如,嗜铬细胞瘤诊断的指标主要是儿茶酚胺类物质,其中多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素间歇性分泌并释放入血,体内半衰期短,离体后化合物不稳定,而游离变肾上腺素是由嗜铬细胞瘤肿瘤细胞内的儿茶酚胺连续产生的,半衰期长,体外稳定性好,对嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)定性诊断具有最佳敏感性和特异性,应是首选的检测指标。

05

临床液相质谱试剂开发的核心:稳定性、准确度、介质的选择和方法学 

液相色谱串联质谱目前主要是开放性仪器,在欧洲及北美质谱检测主要的在具有特定实验室认证资质的实验室 LDT检测。我个人认为,由于新技术产品化的滞后,LDT是新技术发展的不可缺少的过程。对于国内质量体系完善,技术开发能力强的大型第三方独立医学实验室以及技术水平突出的大型三甲医院在经过严格的实验室质量体系考核,室间质评,盲样测试,准确度验证之后应该适度允许开展临床质谱的LDT检测,以实现更早将创新标志物检测技术服务于临床诊断。同时,由于国内优质化学标准品的缺乏,且检验科技术人员习惯于传统的生化免疫自动化平台的情况下,在上述机构外的其他各级医院引入临床质谱技术时,方法学及试剂的标准化则是保证质量的基础。对于大部分医疗机构,引入基于IVD产品的整体解决方案是质量保证的重要途径。对于临床质谱技术而言,其整体解决方案应当包括IVD 认证的仪器,试剂盒,临床验证过的方法学及质量体系,在降低应用门槛适于检验科人员操作习惯同时,确保在质谱技术广泛推广过程中的质量及整个行业的健康发展。


不同于生化免疫抗体及反应体系的试剂开发,质谱检测的是直接检测物质的分子,所以试剂的核心组分是在血清或者其他相应的生物基质中待测物的化学物质。特别是,基质中待测化学物质的含量,或在不同质谱平台检测下所得到浓度以及相应的临床参考范围,应该独立于质谱仪器的品牌及方法学。而目前行业内发展良莠不齐,有人认为质谱试剂只是简单的化学品的混合,已经出现了很多不规范的机构在缺乏严格质量管理体系下,将简单配制形成的劣质产品推向了市场,甚至影响到行业的健康发展。

因此,我认为行业应当针对质谱试剂开发建立规范,特别应该考虑和解决以下几个核心问题:

1、所选的待测物质是不是有临床意义,标注曲线区间的设定及 QC 的浓度是不是覆盖临床意义阳性样本及阴性样本的区间?
2、待测物在基质中是不是稳定?所选的定量标准曲线及QC的基质是不是和待测样品基质相似?
3、待测化合物浓度的准确度是不是经过标准物质的溯源?
4、同位素内标的选择能不能纠正不同样本基质中的离子化的差异;
5、待测物在基质中的化学稳定性,保存及运输稳定性;
6、样品处理能不能有效去除基质效应;
7、HPLC 方法能不能分离内源及外源干扰物质并减少基质干扰;
8、多组分的临床参考范围和疾病诊断的相关性等。

目前,质谱相关的试剂开发及其作为IVD产品的注册是新生的事物,特别是结合多组分及AI算法下形成的临床诊断指标意义、临床实验设计等等,都是开拓性新领域。目前根据体外诊断试剂分类要求,基于临床质谱的检测项目大部分可属于二类,审评及监管权隶属于各个省级药监机构。这些项目对各地审批部门也是新课题,由于缺乏相关的专业人才,极易造成各地审批标准并不统一,从而导致试剂质量存在差异。因此,亟需国家监管部门和业内专家共同探索、制定一套临床质谱试剂开发及认证的统一标准,这会更有利于质谱这一新兴技术领域的健康发展。

06

质控体系和软件

液相色谱-串联质谱仪器多应用于生命科学研究领域,其硬件及软件的功能更侧重于适于研究的灵活性及延展性,从而缺乏适合临床诊断的标准化质量管理体系及相关的软件。目前LC-MS/MS检测多是实验室自建方法(LDTs),尽管目前已有不少检测试剂盒上市,但如果没有良好的质量管理体系,实验室间的差异及不准确性可能会发生。在实验室可能会使用不同型号的仪器、试剂、色谱柱,或者人员变化等都可能导致检测系统的变化的情况下,只有对整个环节做好质量控制,并形成完善的质量管理体系才能更好的保证检验质量。除了做好人员培训及能力评估、样品管理、试剂管理、仪器管理等方面,同时应使用质控对检测环节进行监控。


1、室内质量控制:为监测检测系统的稳定可靠性,判断每批临床样品检测结果的可信度,实验室应按照WS/T 641-2018 临床检验定量测定室内质量控制标准实施室内质量控制。


2、质控物推荐使用和生物样本同基质或相似基质的试剂盒配套质控物。若实验室自配质控物,则应有溯源的记录及评估均匀性和稳定性。可参考CNAS-GL013 量值溯源要求在医学测量领域的实施指南。


3、浓度水平:至少使用2个浓度水平的质控物,且其浓度应位于临床有意义包括阳性及阴性的浓度范围内。使用说明书上的原靶值仅做参考,实验室应重新累积靶值。


4、质控频率:根据实验室检测样品的数量和方法学性能而定,建议在每批次样品检测前、后各运行一次质控样品。


5、质控规则:根据GB/T 20468-2006 临床实验室定量测定室内质量控制指南,至少采用2个质控规则,以检出随机误差和系统误差。


6、接受标准:根据国家卫生健康委临床检验中心(NCCL)组织的室间质量评价。(1)室间质评:为确保实验室间的结果可比性,实验室应按照WS/T 644-2018 临床检验室间质量评价的要求,每年向省级或省级以上室间质量评价计划组织者正确度验证计划;同样也可以参加国内或国外具有室间质评资质的机构来评估实验室检测结果的准确性,比如美国病理学家协会能力验证(CAP PT)、欧洲室间质评(DEQAS)等。(2)其他质量控制指标:由于质谱仪的特殊性,实验室除了关注每日质控和室间质评外,同样还需关注质谱其他可能涉及的指标。① LC-MSMS系统适用性测试:推荐至少在每个分析批次之前或者是当系统平衡出现问题的时候进行系统适用性测试,以确保检测液相质谱系统处于正常状态。检测系统适用性样本用于测试系统适用性的参数有噪音、分析物信号、保留时间、色谱峰分离度和色谱峰对称性以确保仪器正常运行保证检测结果的可靠性。②双空白:由于生物样本基质较为复杂,容易在仪器上基质残留,因此建议在系统适用性符合的情况下检测双空白溶液,在对应分析物的出峰时间处若无干扰,则可继续进行下一步的检测。③内标稳定性:内标是质谱法定量环节中非常关键的一个步骤。每个批次在定量计算前需要分析这些样本中的内标响应是否稳定,比如内标峰面积的CV<20%是否符合。

07

收费标准的缺乏

国内临床质谱发展的另外一个挑战是缺少临床检测收费标准。质谱作为大型精密仪器,仪器成本高、耗材的产业链也不如生化免疫成熟。对于试剂厂家来说,投资建立质谱产品线的的资金成本压力非常高。由于现行的收费标准体系制定先于技术的发展,单个生物标志物的收费低,对于质谱检测多组分的优势而联合收费又有很多的限制,造成临床质谱推广面临商业模式的挑战。比如,传统方法检测激素常不符合临床表现,而国内外学界及行业已形成共识,液相色谱-串联质谱是的激素检测的金标准。然而,由于单个激素指标收费标准远低于仪器折旧及试剂的成本,使得质谱技术应用于激素检测的进程受到显著限制。因此,对于质谱新技术的推广,为其建立特定的方法学收费标准也将是一个必要的条件。 


最后, 任何技术的发展也离不开国家政策的支持,与时俱进的标准检验目录与收费标准,鼓励多组学诊断技术的研发与临床应用。同时发挥监管部门、医疗机构和产业界的各自优势,共同及时引导建立质谱等新技术在临床应用中的标准化工作,在严谨掌握质量的前提下,以创新开放的态度,试点探索新型管理策略,鼓励推进基于质谱技术的体外诊断试剂与仪器的注册工作。


尽管目前临床质谱应用仍有上述诸多挑战,但纵览中国实验室医学数十年的发展历程,像质谱这样代表着更精准的下一代检测技术一定会逐渐得到行业和市场的接受。我相信,随着质谱科研仪器的临床标准化,质谱技术终究会因其高灵敏度,高特异性,以及多通路的检测特点,同时检测结合人工智能的数据分析并形成诊断模型,为未来的精准诊断,疾病预防及健康管理奠定发展的方向。

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注:本文来源于《临床实验室》杂志2020年第12期“回顾与发展”专题